Elisa實(shí)驗(yàn)：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定類型與操作步驟

ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）是將抗原抗體特異性反應(yīng)與酶的高效催化作用結(jié)合的高靈敏度免疫檢測(cè)技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、生物科研、食品檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。本生BUNSEN試劑盒

一、ELISA的測(cè)定類型

間接法?

原理?：先在固相載體上包被已知抗原，加入待檢樣本中的抗體后，再加入酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行結(jié)合，最終通過(guò)顯色反應(yīng)判定結(jié)果。

適用場(chǎng)景?：主要用于檢測(cè)樣本中的特異性抗體，比如HIV抗體篩查、疫苗免疫效價(jià)評(píng)估等場(chǎng)景。

特點(diǎn)?：通用性強(qiáng)，一種酶標(biāo)二抗可適配多種一抗檢測(cè)，成本較低。

雙抗體夾心法?

原理?：使用一對(duì)配對(duì)的捕獲抗體和檢測(cè)抗體，將目標(biāo)抗原夾在中間形成“抗體~抗原~抗體"的三明治結(jié)構(gòu)，再通過(guò)后續(xù)顯色完成定量。

適用場(chǎng)景?：適合檢測(cè)具有2個(gè)以上抗原表位的大分子蛋白，比如細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物等微量物質(zhì)。

特點(diǎn)?：靈敏度高、特異性強(qiáng)，是目前應(yīng)用的定量檢測(cè)類型。

競(jìng)爭(zhēng)法?

原理?：樣本中的待測(cè)抗原和預(yù)先標(biāo)記的已知抗原，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合固相載體上的有限抗體，最終顯色信號(hào)越弱代表樣本中目標(biāo)抗原濃度越高。

適用場(chǎng)景?：專門用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原，比如激素、獸藥殘留等無(wú)法形成雙抗體夾心的物質(zhì)。

直接法?

原理?：將酶直接標(biāo)記在一抗上，直接與包被的抗原結(jié)合后顯色，操作流程更短。

適用場(chǎng)景?：多用于重組蛋白活性驗(yàn)證，目前常規(guī)檢測(cè)中使用占比較低。

二、ELISA通用標(biāo)準(zhǔn)操作步驟

包被?

將捕獲抗體或抗原用包被液稀釋至1——10μg/mL的工作濃度，每孔加入100μL，4℃過(guò)夜孵育12——16小時(shí)，或37℃孵育1——2小時(shí)，讓目標(biāo)蛋白充分吸附在96孔板表面。

封閉?

每孔加入200——300μL的封閉液（1%——5% BSA或5%脫脂牛奶），室溫孵育1——2小時(shí)，封閉固相載體上未結(jié)合蛋白的空白位點(diǎn)，避免后續(xù)步驟出現(xiàn)非特異性吸附。

加樣孵育?

分別加入梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，每孔100μL，37℃條件下孵育1——2小時(shí)，讓樣本中的目標(biāo)分子與包被物充分發(fā)生特異性結(jié)合。

洗滌?

倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入300μL PBST洗滌液，靜置30秒后甩掉液體并在吸水紙上拍干，重復(fù)3——5次，洗去所有未結(jié)合的游離物質(zhì)。

加酶標(biāo)抗體?

每孔加入100μL酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體或二抗，37℃孵育30分鐘——1小時(shí)，完成結(jié)合后再次重復(fù)3——5次洗滌操作，去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。

顯色與終止?

每孔加入100μL TMB底物溶液，室溫避光顯色15——30分鐘，觀察最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔變?yōu)樯钏{(lán)色后，每孔加入50μL 2M硫酸終止液，此時(shí)藍(lán)色反應(yīng)液會(huì)變?yōu)榉€(wěn)定的黃色。

讀數(shù)與結(jié)果分析?

加入終止液后的15——30分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下讀取各孔的吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終計(jì)算出待測(cè)樣本中目標(biāo)物質(zhì)的實(shí)際濃度。

三、關(guān)鍵操作注意事項(xiàng)

洗滌操作必須充分，次數(shù)不足會(huì)導(dǎo)致背景值偏高，洗滌過(guò)度則會(huì)造成特異性信號(hào)減弱，需嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書要求執(zhí)行。

所有加樣步驟必須更換新的吸頭，避免樣本間交叉污染，試劑從冰箱取出后需恢復(fù)至室溫再使用，樣本禁止反復(fù)凍融。

實(shí)驗(yàn)必須同步設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，待測(cè)樣本建議設(shè)置復(fù)孔，保證最終結(jié)果的準(zhǔn)確性。

TMB底物溶液對(duì)光敏感，需避光保存和使用，顯色過(guò)程中需動(dòng)態(tài)觀察顏色變化，精準(zhǔn)把控終止時(shí)機(jī)。

注：以上資料僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說(shuō)明或咨詢技術(shù)老師。

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